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1. 為了避免物品間的交叉污染，整個工作過程中所需要的物品應在工作開始前一字排開放置在安全柜中，以便在工作完成前沒有任何物品需要經過空氣流隔層拿出或放入，特別注意：前排和后排的回風格柵上不能放置物品，以防止堵塞回風格柵，影響氣流循環。
2. 在開始工作前及完成工作后，需維持氣流循環一段時間，完成安全柜的自凈過程，每次試驗結束應對柜內進行清潔和消毒。
3. 操作過程中，盡量減少雙臂進出次數，雙臂進出安全柜時動作應該緩慢，避免影響正常的氣流平衡。
4. 柜內物品移動應按低污染向高污染移動原則，柜內實驗操作應按從清潔區到污染區的方向進行。操作前可用消毒劑浸濕的毛巾墊底，以便吸收可能濺出的液滴。
5. 盡量避免將離心機、振蕩器等儀器安置在安全柜內，以免儀器震動時濾膜上的顆粒物質抖落，導致柜內潔凈度下降；同時這些儀器散熱排風口氣流可能影響柜內的氣流平衡。
6. 安全柜內不能使用明火，防止燃燒過程中產生的高溫細小顆粒雜質帶入濾膜而損傷濾膜。
為了保障生物安全柜的安全性，應定期對安全柜進行維護和保養：
1. 每次使用前后應對安全柜工作區進行清潔和消毒。
2. HEPA過濾器的使用壽命到期后，應由接受過生物安全柜專門培訓的專業人員更換。
3. WHO頒布的實驗室生物安全手冊、美國生物安全柜標準NSF49和中國食品藥品監督管理局生物安全柜標準YY0569都要求有下列情況之一者，應對生物安全柜進行安全檢測：安裝完畢投入使用前；一年一度的常規檢測；當安全柜移位后；更換HEPA過濾器和內部部件維修后。
安全檢測包括以下幾個方面：
1. 進氣流流向和風速檢測：進氣流流向采用發煙法或絲線法在工作斷面檢測，檢測位置包括工作窗口的四周邊緣和中間區域；進氣流風速采用風速計測量工作窗口斷面風速。
2. 下沉氣流風速和均勻度檢測：采用風速儀均勻布點測量截面風速。
3. 工作區潔凈度檢測：采用塵埃粒子計時器在工作區檢測。
4. 噪聲檢測：生物安全柜前面板水平中心向外300mm，且高于工作臺面380mm處用聲級測量噪聲。
5. 光照度檢測：沿工作臺面長度方向中心線每隔30cm設置一個測量點。
6. 箱體漏泄檢測：給安全柜密封并增壓到500Pa，30分鐘后在測試區連接壓力計或壓力傳感器系統用壓力衰減法進行檢測，或用肥皂泡法檢測
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